技术专栏

Q1：ELISA试剂盒的标准品为什么要做成冻干粉，为什么不用稀释好的液体标准品溶液？

A：冻干工艺（冷冻干燥）通过将蛋白质溶液在低温下脱水冻干，能够最大限度地 保持生物活性 ，延长保存期限。冻干粉形式的标准品在常温下更便于运输和储存，避免了溶液状态下可能发生的蛋白降解或微生物污染问题。

 

Q2：配好的标准品能放多久，我三天之后还能用吗？

A：标准曲线要求现配现用。最大浓度的标准品（如本文举例中的200pg/mL）可在4℃放置7天，-20℃放置1个月，避免反复冻融。其他浓度由于含量太低，24小时就会发生大幅降解，因此其他浓度（除最大浓度外的）是必须现配现用的

 

Q3：标准品溶解后发现有少量不溶物怎么办？  

A：可以再适当延长静置时间，或再次轻柔涡旋。如果始终不溶解，可能意味着标准品已失活或变性，建议联系供应商咨询。

 

Q4：为什么我做的标准曲线和说明书上的标准曲线的OD值不一致，是不是实验做失败了？

A：由于操作人员的习惯，实验环境条件，洗板手法、显色终止时间都无法做到绝对的精确和一致，因此每次的标准曲线都会有一定的差异。实际只要标曲最高浓度的OD值在1.0-3.5之间，并且所有浓度的标曲OD值都有明显的差异，均可视为有效标曲。

 

Q5：每次都必须做标准曲线吗，能否用说明书上的标曲或者用上次做过的标曲？

A：是的，每次都必须重新做标曲，因为标曲是反应本次ELISA实验是否成功的标志。如果不做标曲就不能判断本次实验是否是做成功的，造成样本测值假阳性或假阴性的结果

 

Q6：如果我的样本预期浓度很高或者不确定样本样本浓度不知道稀释后是否超过了曲线范围内怎么办？  

A 具体稀释倍数可根据文献数据、实验经验等进行预实验或者咨询技术支持

 

Q7：标准曲线无梯度怎么办？
A：无梯度通常意味着样品或标准品污染、错误的稀释、偶联抗体浓度过高或显色时间过长。需要检查操作流程，避免污染，严格按照说明书进行稀释。

 

Q8：标准曲线R²值低是什么原因？
A：R²值低表明标准曲线的拟合度差，可能由于数据点分布不均匀或实验误差大。增加标准品的浓度梯度点，减少操作误差可以改善。

 

Q9：标准曲线最高点吸光值偏高怎么办？
A：吸光值偏高可能是显色过度或单波长检测引起的非特异性信号。控制显色时间，建议使用双波长检测可以减少非特异性信号的影响。

 

Q10：标准曲线最高点吸光值偏低怎么办？
A：可能是标准品未充分溶解、反复冻融导致活性降低或孵育条件不当。确保标准品充分溶解，避免反复冻融，按照说明书要求进行孵育。还有可能是显色时间和温度和合适，需要保证正确的显色温度，适当延长显色时间。

ELISA实验的标准品处理是一门融合了科学原理与操作艺术的精细工艺。每一个细节都可能成为影响结果的关键因素。只有严格遵循操作规范，理解其中的原理，才能制作出理想的标准曲线，获得可靠、准确的实验结果。

细节决定成败 ，精确才是王道。