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ELISA实验操作---标准品复溶及稀释

在ELISA（酶联免疫吸附试验）中，标准曲线的质量直接决定了实验结果的可靠性与准确性。一条理想的标准曲线不仅需要良好的线性关系，还需要覆盖足够的动态范围，能够准确反映样本中待测物的真实浓度。 而标准曲线的制作，始于标准品的正确处理——复溶与稀释。

一、标准品复溶

试剂平衡：将ELISA试剂盒从4℃冰箱中取出，将标准品冻干粉和标准品稀释液放置于室温平衡20分钟 左右。避免低温下溶解不完全和因温度差异导致浓度计算不准。

短暂离心：在打开标准品粉末管盖之前，先进行短暂离心（例如10000 rpm离心1分钟），目的是将因运输颠簸而附着在管壁或管盖上的粉末全部沉降到管底。

加液重悬：加标准品&样品稀释液 1mL 至冻干标准品中加标准品&样品稀释液 1mL 至冻干标准品中，旋紧管盖，静置 10 分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀，避免起泡，此浓度即为本试剂盒的标准曲线最高浓度（例如，RE3186M Mouse IL-6 ELISA Kit 检测范围为3.12-200pg/mL,则此浓度标准品为标曲的第一个浓度200pg/mL）。

关键注意：在粉末完全溶解前，避免用移液枪猛烈吹吸 ，以免未溶解的蛋白粉末被枪头带出，导致实际浓度降低。

二、标准品的梯度稀释

溶解好的标准品冻干粉需要稀释成一系列不同浓度的标准品点来绘制曲线，一般按照2倍比梯度来稀释。取7支洁净的1.5mL EP管，依次标记为A-G，每管加入250μL标准品&样品稀释液（也可根据实际用量来确定，比如500μL）

 

梯度稀释操作（以倍比稀释为例） ：
以RE3186M，标准品200pg/mL为例。ELISA的标准曲线一般是由8个点组成7个梯度浓度+1个稀释液作为空白对照。以下分别为标准品稀释的示意图以及稀释的操作表：

 

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注意事项：

•  充分混匀 ：每完成一个梯度的稀释，都必须使用移液器 吹打10次并且涡旋振荡5秒使其充分混匀，然后再进行下一步稀释。这是保证梯度准确性的最重要一步。
•  短暂离心 ：在从上一个浓度管中吸取液体前，可先短暂离心一下，将管盖和管壁上的液珠离心至管底，确保吸取体积的准确性。

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标准品稀释视频：