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在生命科学领域，蛋白定量是经常用到的研究手段，相信大家都曾被这样的问题困扰：面对ELISA、BCA、化学发光等十余种蛋白定量方法，到底该选哪一种？

瑞迪生物推出蛋白定量检测系列文章共三期，本期推文作为系列的开篇基础篇，先为大家拆解当前十余种主流方法的核心分类逻辑，再详细解析非特异性蛋白检测和常用的单因子特异性检测。从原理、实操到适用场景，一站式吃透基础方法，帮你快速拿捏常规蛋白定量实验！

一、两大核心分类
蛋白定量检测的分类依据，核心是“是否依赖抗原-抗体特异性结合”，据此分为两大类别，适配不同实验需求，逻辑清晰不混乱：
（一）非特异性蛋白定量检测（快速搞定总蛋白定量）
核心特点：不依赖与抗原-抗体结合，基于蛋白的共性特征（如芳香族氨基酸的紫外吸收、与染料的显色反应等）定量，仅能检测样本中“总蛋白”含量，适用于无需区分具体蛋白、只需知道总蛋白浓度的场景。本期介绍常用的三种方法。
（二）特异性蛋白定量检测（精准靶向特定蛋白）
核心特点：必须依赖抗原-抗体的特异性结合，针对目标蛋白进行定量。特异性极强，是科研、临床最常用的核心类别，适用于对已知靶蛋白的精准检测。本期介绍的三种常规单因子检测是基础中的基础，后续进阶篇还会介绍超灵敏、多重检测等类别。

二、非特异性总蛋白检测：3种方法按需选
1. 紫外吸收法
核心原理：蛋白质中酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，在280nm波长处有特异性紫外吸收，一定浓度范围内吸光度与蛋白浓度成正比，无需显色试剂，直接检测即可。
实操关键：样本稀释至适宜浓度→加入比色皿中→紫外分光光度计设定280nm（以空白缓冲液为对照）→测吸光度→计算浓度，全程5-10分钟完成。
核心优势：操作简便、快捷，成本极低，不破坏蛋白结构（样本可回收用于后续实验）。
注意事项：特异性差，易受干扰（主要来自核酸， 在260nm 有强吸收，会叠加到 280nm 信号中，若样品中混有核酸，需通过 A280/A260 比值来校正结果）。
适用场景：适用于纯度较高的的蛋白样本，如：纯化蛋白浓度测定、蛋白纯化过程中的浓度监控等。
2. BCA法
核心原理：蛋白在碱性条件下与Cu2+结合，将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂结合形成紫色络合物，在562nm波长有最大吸收，吸光度与蛋白浓度在一定范围内具有相关性。
实操关键：配制BCA工作液→加标准蛋白/样本→加BCA工作液→37℃孵育30min→酶标仪测562nm吸光值。
核心优势：线性范围宽，抗干扰能力强（可耐受一定浓度去污剂），结果相对稳定，是总蛋白定量的“首选”。
适用场景：各类样本总蛋白定量、批量样本检测等。
3. 考马斯亮蓝法（Bradford法）
核心原理：考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下呈红色，与蛋白结合后转变为蓝色，在595nm波长处有最大吸收，吸光度与蛋白浓度一定范围内具有相关性。

实操关键：配制染色液→加标准品/样本→加染色液→室温孵育5-10分钟→测595nm吸光度。
核心优势：成本低，操作简便，适合大规模快速初筛。
注意事项：线性范围较窄，抗干扰能力弱（易受去污剂、电解质等的影响）
适用场景：适用于纯度较高的的蛋白样本，如：纯化蛋白浓度测定、蛋白纯化过程中的浓度监控等。
 

三、特异性单因子检测：ELISA+化学发光法+TR-FRET
1. ELISA（酶联免疫吸附测定）
核心原理：将抗原/抗体包被在聚苯乙烯微孔板上，通过抗原-抗体特异性结合，酶结合物催化底物显色，显色强度与蛋白浓度一定范围内具有相关性。
实操关键：（以双抗体夹心法为例）：固相包被捕获抗体→加标品/样本→加生物素化检测抗体→加酶结合物→显色→酶标仪读数。

核心优势：技术成熟、操作简便，适配血清、血浆、细胞上清等多数样本。
适用场景：常规科研蛋白定量、新手入门实验。
2. 化学发光法（CLIA）
核心原理：基于抗原-抗体特异性结合，通过化学发光底物产生可见光，发光强度与靶蛋白浓度一定范围内具有相关性；无需外界光源激发，背景远低于传统显色法，灵敏度比ELISA高一个量级。
实操关键：包被抗体→加样本→加酶标抗体→加发光底物→读数计算浓度。

核心优势：灵敏度较高，操作简便快速、成本适中，适配对灵敏度有要求，但预算有限的实验。
适用场景：临床诊断、科研中ELISA灵敏度不足的场景、常规高灵敏度蛋白定量。
3. TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
核心原理：利用FRET现象，供体/受体荧光基团偶联特异性抗体，与靶蛋白结合后（距离＜10nm）产生能量转移，根据特异性荧光进行定量。
实操关键：样本+供体/受体抗体→同一体系孵育→时间分辨荧光仪检测。
核心优势：高信噪比，均相、无需洗板，操作简便快速。
适用场景：药物筛选、蛋白结合实验、常规蛋白的快速批量定量。
注意事项：依赖荧光标记抗体，对反应条件（温度、时间）要求较高。

四、基础篇总结
1.  蛋白定量先分两类：特异性检测（精准测单一蛋白）、非特异性检测（测总蛋白）。
2.  总蛋白检测：求稳选BCA法，求快选紫外吸收法，求省钱选考马斯亮蓝法。
3.  常规单因子检测：ELISA（低成本首选）、化学发光法（高灵敏度替代）、TR-FRET（免洗涤，高通量）。

以上就是蛋白定量基础篇全部内容，掌握这些，已经能应对80%的常规实验需求啦！下一期进阶篇，我们将重点拆解“一次检测多种蛋白”，“低丰度蛋白精准定量”核心方法，如Luminex、Simoa等，请持续关注！