技术专栏

1. ELISA实验中为什么在制备组织匀浆和细胞提取液时建议使用蛋白酶抑制剂？
在制备组织匀浆或细胞提取液时，组织或细胞内源性蛋白酶（如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等）会被释放，可能导致以下问题：
① 靶蛋白降解： 目的蛋白会被内源性蛋白酶降解，导致假阴性结果。
② 蛋白片段干扰： 目的蛋白降解后产生的短肽可能会非特异性结合ELISA抗体，导致背景OD值升高。
如果不使用蛋白酶抑制剂，可能会导致：
① 假阴性结果： 降解导致靶蛋白的量减少，无法正确检测；
② 数据波动大、重复性差：样本中的蛋白降解程度不同，导致数据不一致；
③ 背景OD值升高：降解产物与抗体结合，产生非特异性反应，影响实验的准确性；
④ 样本无法长期保存： 即便在-80℃条件下，残留的蛋白酶也会缓慢降解蛋白，尤其是组织匀浆；
因此，在样本制备过程中，使用蛋白酶抑制剂能有效保护目标蛋白，确保实验结果的可靠性；

2. ELISA实验样本是否可以使用含RIPA裂解液提取目的蛋白？
不建议使用RIPA裂解液。RIPA裂解液含有SDS等表面活性剂，这些物质会干扰抗原与抗体的结合，进而影响ELISA实验的准确性。为确保实验结果的稳定性和准确性，应选择适合的裂解液。

3. 推荐使用的蛋白酶抑制剂及添加量？
推荐使用PMSF（苯甲基磺酰氟）作为蛋白酶抑制剂。
PMSF通常以10 mg/mL浓度储存，其有效浓度为17~174 μg/mL。
组织匀浆制备： 1 g组织：9 mL 0.01M PBS（pH=7.4）缓冲液，建议加入17.03~177.08 μL的PMSF，具体量可根据实际操作浓度调整，保持在有效浓度范围内即可。
细胞提取液： 如果使用150-200 μL 0.01M PBS（pH=7.4）缓冲液重悬细胞，建议加入3-35 μL PMSF，具体量可根据实际操作浓度调整，保持在有效浓度范围内即可。